原标题：科普 | CircRNA测序技术简介
circRNAs（Circular RNAs，环形RNA分子）是一类不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。由于环状RNA对核酸酶不敏感，所以比线性RNA更为稳定，这使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。
1993年，在小鼠精子决定基因Sry中发现环状转录。1979年，洛克菲勒大学的Hsu和Coca-Prados在电子显微镜下首次在真核细胞细胞质中观测到环状RNA的存在。2012年，Salzman通过RNA-Seq测序方法首次报道了~80个环状RNA。 目前筛选circRNA主要有两种途径，一是高通量测序，二是芯片检测。区别于芯片预制好的只能检测有限数量circRNA分子，高通量测序不仅通量大、信息准确，而且可以发现新的circRNA，是目前筛选circRNA最有效、性价比最高的方法。随着高通量测序以及生物信息分析的加快速度进行发展，从古细菌到人中发现了成千上万的circRNA。
circRNA电镜照片
《2018研究前沿》中，据统计circRNA已陆续荣登生物科学TOP10热点榜单和新兴前沿榜单，其细胞定位、成环机制和功能研究的热度不减，俨然是非编码RNA领域最火热的明星分子。
circRNA在不同疾病中的功能概述和研究进展（Han et al., 2018）
CircRNA的种类
CircRNA的种类按其来源可以归类为以下四种：
- 全外显子型的circRNA；
- 内含子和外显子组合的EICircRNA；
- 内含子组成的套索型ciRNA；
- 由病毒RNA基因组、tRNA、rRNA、snRNA等环化产生的circRN
目前，大部分被鉴定的circRNAs属于ecircRNAs。
（1）circRNAs由于是封闭环状结构，所以没有5-3’的极性，也没有polyA尾巴。因此，比线性RNA稳定，不容易被RNA核酸外切酶或者RNase R降解。在健康人的唾液细胞里发现了400种以上的circRNAs。
（2）circRNAs表达丰度差异大，在某些情况下，环状分子是其对应线性mRNA表达丰度的10倍以上。
（3）circRNAs大部分有外显子组成，主要存在于细胞质中，可能有miRNA结合的原件（MREs）。一些含有保留内含子区域的circRNA定位在真核生物的细胞核，可能调控了基因的表达。
（4）circRNAs通常是组织特异性和发育不同阶段特异性的。比如，has_circRNA_2149 只在CD19+白细胞而不是CD34+白细胞、中性粒细胞或者HEK293中表达。一些线虫circRNAs在卵母细胞中表达，在1-或者2-细胞胚胎中不表达。
（5）绝大部分的circRNAs是内源非编码RNAs，只有一小部分是外源的circRNAs，如HDV，含有核糖体进入位点（IRESs）的人工circRNAs。
（6）不同物种间的circRNAs大部分是进化保守的，也有部分是进化不保守的。
总的来说，circRNAs的这些特性决定了它们在转录和转录后的及其重要的作用，也暗示着其可能作为疾病诊断的理想biomarker。
circRNA没有一种普遍的作用模式，它以许多不同的方式来调控基因表达和蛋白合成。circRNA转录后的主要功能是： circRNA能与蛋白质结合，募集蛋白质复合体的组分或调控基因的表达；circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成；circRNA可当作“sponge”海绵吸miRNA ，调节靶基因； circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平。
circRNA作用机制
circRNA主要存在于细胞质或外泌体中，具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征。近几年，大量的研究表明circRNA在生物的生长发育、胁迫应答、疾病发生和发展等方面密切相关，并预测其在疾病诊断标记物等方面的应用前景，但其生物学功能在很大程度上仍然未知。
1. circRNA竞争性吸附miRNA
circRNA富含miRNA结合位点来充当miRNA海绵作用，阻止miRNA在3′ 非翻译区与mRNA相互作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。
2.circRNA调节RNA结合蛋白（RBP）
circRNA通过与mRNA调节的结合蛋白（RBP）结合，进而改变剪接模式或mRNA稳定性。
3.circRNAs调控可变剪切或转录过程
circRNA与RNA聚合酶Ⅱ相互作用并调节转录，或者EIcircRNA可与小核糖核蛋白互作用，再与RNA聚合酶Ⅱ结合。
4.circRNA的编码功能
circRNA虽然属于非编码RNA，但是研究人员推测了circRNA的另外一些新的功能，比如可当作RBP的海绵吸附体，直接与靶基因结合，直接作为模板翻译。
circRNA生物功能的调控机制图（Zhang et al., 2018）
circRNA研究策略最重要的包含以下几个环节：
circRNA研究策略 （来源欧易生物）
由于生物体内circRNA的含量比较低，circRNA的测序主要通过去除样品中的rRNA并消化线性RNA来提高circRNA的富集度，建库测序后，可进行circRNA鉴定、分布统计、注释分析、表达量计算、circRNA保守性分析及互作miRNA、mRNA等分析，深度挖掘circRNA的功能与作用机制。
circRNA技术流程
circCAMSAP1通过miR-328-5p / E2F1轴促进大肠癌中的肿瘤生长。
标题：circCAMSAP1 Promotes Tumor Growth in Colorectal Cancer via the miR-328-5p/E2F1 Axis.
杂志：Molecular Therapy
发表时间：2020
IF：8.402
DOI: 10.1016/j.ymthe.2019.12.008
通讯作者：Xian-rui Wu和兰平教授（中山大学附属第六医院）
该研究主要探讨了circRNA在大肠癌（CRC）中的作用机制。首先研究者通过8对CRC和癌旁组织的circRNA高通量测序，得到CRC的circRNA表达谱。在CRC组织中，circCAMSAP1（起源于CAMSAP1基因的2号和3号外显子，hsa_circ_0001900）被显著上调。circCAMSAP1表达增加与晚期肿瘤/淋巴结转移（TNM）阶段和总体生存期缩短密切相关。数字PCR检测CRC患者血清中circCAMSAP1表达显示术前升高。在功能上，circCAMSAP1促进了CRC的恶性行为。circCAMSAP1上游生物形成机制研究表明，CRC中ESRP1介导circCAMSAP1的环化。此外，circCAMSAP1可竞争性吸附miR-328-5p，进而解除了miR-328-5p对转录因子E2F1的抑制作用。该研究结果表明circCAMSAP1 / miR-328-5p / E2F1轴在CRC的进展中起着至关重要的作用，这在某种程度上预示着circCAMSAP1可当作CRC的诊断和预后生物标志物以及潜在的治疗靶标。
Abstract
Increasing studies indicated that circular RNAs (circRNAs) play important roles in cancer progression. However, the roles of circRNAs in colorectal cancer (CRC) remain largely unknown. In this study, we determined the circRNA expression profile by next-generation RNA sequencing from eight CRC and paired non-cancerous matched tissues. circCAMSAP1 (originating from exon 2 to exon 3 of the CAMSAP1 gene, hsa_circ_0001900) was significantly upregulated in CRC tissues. Increased circCAMSAP1 expression was significantly correlated with advanced tumor/node/metastasis (TNM) stage and shortened overall survival. An elevation of circCAMSAP1 expression was detected via droplet digital PCR in the serum of CRC patients prior to surgery. Functionally, circCAMSAP1 promoted the malignant behavior of CRC. Mechanism study of upstream biogenesis of circCAMSAP1 indicated that circCAMSAP1 cyclization in CRC was mediated by splicing factor epithelial-splicing regulatory protein 1. Moreover, circCAMSAP1 acted as a sponge for miR-328-5p and abrogated its suppression on transcription factor E2F1. Taken together, our data indicated an essential role of the circCAMSAP1/miR-328-5p/E2F1 axis in the progression of CRC, which implied that circCAMSAP1 could serve as a diagnostic and prognostic biomarker as well as a potential therapeutic target for CRC.
circCAMSAP1 / miR-328-5p / E2F1信号轴促进大肠癌进展示意图
1. cricRNA 测序和普通的 RNA-seq，在抽提 total RNA 时有区别吗？
circRNA 测序对 total RNA 的要求与普通的 RNA-seq 相同，所以抽提方法也相同。但是由于 circRNA 建库需要去除 rRNA 和线性 RNA，所以需求大量的 total RNA，需提供 ≥22 μg 的 total RNA，其中 20 μg 用于 circRNA 建库。
2. circRNA建库测序与其他RNA-seq相比，有何不同？
两种测序方式的相同之处为都能够得到 circRNA 序列信息。不同之处在于，全转录组测序除了 circRNA 序列信息外，还能够得到 mRNA 和 lncRNA 的序列信息，能够直接进行 circRNA-mRNA、lncRNA-mRNA 关联分析和网络构建，lncRNA 的调控机制（cis 和 trans）等分析；但由于建库方式的差异和测序数据量的限制，全转录组测序所获得的 circRNA 类型通常比 circRNA 测序要少。而 circRNA 测序，只能获得 circRNA 序列信息，但 circRNA 测序能够得到比全转录组测序更多的 circRNA 类型，可以对 circRNA 的剪接模式和 circRNA 类型进行更细致、深入的分析，便于发现新的 circRNA。
3.芯片circRNA研究与二代测序技术有啥不一样的区别？
由于目前对circRNA的研究相对较少，注释并不全面，由于芯片只能检测已知环状，因此会缺失许多新的circRNA信息以及大量特异表达的circRNA。二代测序技术通过软件进行环状RNA鉴定，既可以鉴定已知环状RNA，也可以预测新的环状RNA。因此，对于环状RNA研究而言，二代测序获取信息更全面。
4.全转录测序和circRNA测序推荐多少数据量？
全转录组测序，一般推荐数据量20 Gb；单纯的circRNA测序，一般推荐数据量10 Gb。
参考文献
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Zhou, Chi, et al. CircCAMSAP1 Promotes Tumor Growth in Colorectal Cancer via the MiR-328-5p/E2F1 Axis. Molecular Therapy, vol. 28, no. 3, 2020, pp. 914–928.
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